| 详细介绍： 慢性经口毒性试验
Chronic Oral Toxicity Study
中国科学院广州化学研究所分析测试中心
卿工----18933946343
中国科学院分析测试中心由国务院吸收国外先进技术于2005年组建。下设危险废物鉴定实验室、二恶英实验室，化学与药学分析室，材料与形貌分析室，环境与能源分析室，生物与药学分析室。
1 范围
本规范规定了动物慢性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化学品的慢性经口毒性。
2 规范性引用文件
OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.452, 12 May 1981)
USEPA OPPTS Health effect Test Guideline (Serious 870.4100，June 1996)
3 试验目的
通过经口途经，反复给予试验动物不同剂量的受试化学物，观察试验动物的慢性毒性效应、严重程度、靶器官和损害的可逆性，确定无作用剂量，为拟定人类接触该化学物的工作场所职业接触限值（OEL）和每日容许摄入量（ADI）的制订提供依据。由于另设试验研究致癌性，故致癌性并不是本试验的主要内容。
4 定义
4.1 慢性经口毒性（Chronic Oral Toxicity）：动物在正常生命期的大部分时间内经皮接触受试样品所引起的健康损害效应。
4.2无可见有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量。可用每日单位动物体重接触受试样品的重量(mg/kg bw·d)表示。
4.3最低可见有害作用水平（Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL）：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量。可用每日单位动物体重接触受试样品的重量(mg/kg bw·d)表示。
4.4 靶器官(Target organ)：实验动物出现由受试样品引起的明显毒性作用的任何器官。
5 试验的基本原则
在实验动物的大部分生命期间将受试样品经口途径染毒，通常动物连续染毒1年以上，观察动物的中毒表现，并进行生化指标、血液学指标、病理组织学等检查，以阐明此化学物质的慢性毒性。
6 试验方法
6.1 受试样品 在开始本试验之前，应尽量搜集受试样品现有的各种资料。
6.1.1 受试样品的商品名和其他名称（包括CAS号）。
6.1.2 受试样品的结构式、分子式和分子量。
6.1.3 受试样品的物理、化学性质(可包括：外观、沸点、熔点、比重、折射率、光谱资料、溶解度、挥发性、化学活性、光化学性质、电离度、粒度、密度等)。重要的参数还包括稳定性（包括在赋形剂或饲料中）。
6.1.4 受试样品的分析方法。
6.1.5 受试样品的生产方法、合成路线和杂质。
6.1.6 储存方法：要有长期储存受试样品（包括在赋形剂或饲料中）的合适方法。否则需定期制备新鲜样品。
6.1.7 人类每日可能接触的水平。
6.1.8 接受受试样品的日期应登记。开始试验前应有适当数量的受试样品，来源和批号应相同，尽可能使用同一批生产的受试样品，否则，每一批受试样品的纯度和杂质要分别测定。
6.2 实验动物和饲养环境
为选择合适的动物种类和品系，应该进行有关的急性、亚急性、亚慢性、蓄积毒性甚至毒物动力学试验。所选用的品系应是对该类受试样品的慢性毒性作用敏感。通常需用两种动物进行慢性试验，一种为啮齿类动物，首选大鼠；另一种为非啮齿类动物，常用狗或灵长类动物，但国际上对使用这类动物有诸多限制。如果仅有啮齿类动物的资料，将资料外推到人时敏感性降低。
实验动物和动物实验的环境设施应符合国家相应规定，必须有合理的动物管理措施并严格控制环境条件，尽量减少人员流动。饲养条件、疾病、药物治疗、饲料的杂质、空气、饮水、垫料等都可能对试验结果产生巨大影响。
每一房间只能饲养一种动物；每一房间只供一种受试样品试验用（除非有证据表明不同受试样品对动物无影响），也应考虑受试样品对对照组动物的影响。
笼具等物品应便于消毒和清洁，应避免使用消毒剂和农药等，特别是与动物有密切接触的部位更应注意，因为这类活性物质对试验结果可能产生影响。
饲料应满足动物营养需要，应定期分析饲料成分（包括营养成分和杂质等），不含对试验有影响的杂质，分析结果应在鉴定报告列出。
如果受试样品掺在饲料或饮水中染毒，应测定受试样品在饲料或饮水中的稳定性和均匀性。在试验开始前应制定定期制备受试样品饲料或饮水的时间表。
如果受试样品的毒性较低，则加入饲料的受试样品比例较大，应注意混入饲料中的受试样品不应超过5%，否则会对动物正常营养产生影响。
应评估饲料消毒对营养成分的影响，并对损失的营养成分作适当补充。对化学消毒剂（如环氧乙烷）的消毒效果应进行生物检测。
必要时对饮水的水质也应监测。
食盒内饲料应定期更换，约每周一次。动物自由饮水。
6.3 实验动物的年龄、数量和性别
啮齿类动物断奶后作短期适应环境之后要尽快开始试验，尽早使动物在生长的快速期接触受试样品。每组动物不少于50只（非啮齿类动物每组至少8只），雌雄各半，同性别体重差异不超过平均体重的10%。如试验期间计划提前剖杀一些动物，或在染毒结束时留一部分动物观察，试验开始时要相应增加动物数量。试验结束时各剂量组每种性别的动物能满足统计学要求（每组每性别动物应不少于10只）。
6.4 剂量组和染毒频率
至少要设三个剂量组及一个相应的对照组。剂量选择可根据急性毒性、亚急性毒性、亚慢性毒性、蓄积毒性和代谢研究等资料确定。高剂量组可以出现某些较轻或较明显的毒性反应，个别动物可能死亡；低剂量不应引起任何毒性反应；中剂量界于高剂量和低剂量之间，动物可能产生轻微的毒性效应。
通常每天染毒一次，但根据染毒途径而有不同。受试样品加入饲料或饮水中进行经口试验时可连续染毒。染毒频率可根据毒物代谢学资料而调整。
6.5 对照组
必须设立对照组。对照组动物不接触受试样品及其它赋形剂，其它条件均与染毒组相同。若染毒必须加入溶剂或添加剂，这些溶剂或添加剂不应影响受试样品的吸收或引起毒性作用，同时还应设相应的助剂对照组。
6.6 染毒途径
可将受试样品混入饲料或饮水，或采用灌胃法或药囊法染毒。受试样品混在饲料或饮水中应每周7天染毒，如灌胃或用药囊法，考虑到实际工作方便，也可每周染毒5天，但染毒停顿可使动物得到一定程度恢复，或会影响结果及最后的评价。
6.7 染毒周期
动物连续染毒1年以上，小鼠通常为一年半，大鼠通常为两年。6.8 临床观察
试验期内每天至少详细观察一次，还应增加必要的观察次数并采取适当的措施尽量减少动物损失，如对死亡动物进行解剖，对质弱或濒死动物隔离、处死、冷藏并剖验，仔细记录毒性作用的开始时间及其进展情况，减少因疾病、自溶或被同类所食造成的动物损失。
观察期间对动物的任何毒性表现均应记录，包括神经系统、眼睛变化、肿瘤和死亡等，记录其开始时间及进展情况。
记录体重变化。前13周每周记录体重一次，此后每4周记录一次。在前13周每周记录一次饲料消耗量，此后如动物健康状况或体重无异常改变可3个月记录一次。经饮水染毒时应记录饮水消耗量，以便计算受试样品摄入量。
6.9 血常规检查和其它血液指标检查
检查指标可包括血红蛋白浓度、血球压积、红细胞数、血小板数、白细胞计数与分类、凝血功能等指标。在染毒开始后第3和第6个月各检查一次，此后每隔约6个月检查一次，试验结束时一次。大鼠每组每性别可检查10只，非啮齿类动物应全部检查。每次检查的动物最好相同。
在实验过程中如有动物健康状况恶化，对该动物作白细胞分类计数。
血细胞分类计数通常先在最高剂量组和对照组进行，如高剂量组有问题才依次再检查较低剂量组动物。
6.10 尿液检查
收集各组动物尿样进行分析，大鼠每组每性别可检查10只，非啮齿类动物应全部检查，每次检查的动物最好相同，检查时间间隔与血常规检查一致。应检查下列指标：
外观：每只动物的尿量和尿比重；
蛋白，糖，酮体，潜血；
沉淀物镜检（半定量）。
6.11 临床生化检查
在第6个月及实验结束时进行。大鼠每组每性别可检查10只，非啮齿类动物应全部检查。每次检查的动物最好相同。检查指标包括：
总蛋白浓度、白蛋白浓度、肝功能试验（如碱性磷酸酶，谷氨酸氨基转移酶，天门冬氨酸氨基转移酶，γ-谷氨酰转肽酶、鸟氨酸脱羧酶等）、糖代谢、肾功能如血尿素氮等。
6.12 病理检查
病理检查，包括肉眼大体检查和镜检是慢性毒性试验的重要部分。应全面检查、详细描述和记录。
6.12.1 肉眼剖检
肉眼剖检是病理检查重要的一环，如果做得好，对镜检有极大帮助。。所有动物，包括在实验过程中死亡或濒死而被处死的动物均应进行肉眼检查。如果处死动物，处死前应收集其血样进行血细胞分类计数。保存所有肉眼可见病变、肿瘤或可疑肿瘤组织。应分析肉眼剖检与镜检结果的对应情况。
所有的器官组织都应保存并进行镜检。一般包括下列器官和组织：脑*、(髓/脑桥，小脑皮质，大脑皮质)、垂体、甲状腺 (包括甲状旁腺)、胸腺、肺 (包括气管)、心脏、主动脉、唾液腺、肝*、脾、肾*、肾上腺*、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、子宫、膀胱、淋巴结、胰腺、性腺*、生殖附属器官、雌性乳腺、皮肤、肌肉、外周神经、脊髓 (颈，胸，腰段)、胸骨或股骨 (包括关节)和眼睛。肺和膀胱用固定剂填充能保存更好。在吸入试验，整个呼吸系统的组织器官包括鼻、咽喉等均应检查。
以上有*号者需称重，大鼠每组每性别可称10只，非啮齿类动物包括甲状腺及甲状旁腺应全部称重。
6.12.2 组织病理检查
6.12.2.1 所有肉眼可见的肿瘤和其他病变都应进行病理检查。并可循以下顺序检查：
6.12.2.2对所有有病变的组织器官进行镜检并详细描述，包括：在试验中途死亡或处死的动物；所有高剂量组和对照组动物。
6.12.2.3较低剂量组动物的病变，而且这些病变是由于受试样品引起或可能由受试样品引起的。
6.12.2.4某一剂量组病理镜检有问题时，下一剂量组需作检查。
6.12.2.5各组动物（包括对照组动物）有共同病理损害时，应对剂量组动物的病理改变程度作出评估。
6.13 试验结果处理与评价
6.13.1 结果的处理
可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现毒性反应的动物数、毒性反应的类型和动物出现毒性反应的百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方法应在试验设计时确定。
6.13.2 试验结果的评价
慢性毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试样品染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用。成功的慢性试验应能够提出统计学上有意义的无作用水平（NOAEL）。
7 鉴定报告
鉴定报告包含的内容参见亚慢性试验，而且还必须包括以下内容：
7.1 该试验在何实验室完成，实验室的名称和地址；
7.2 试验日期；
7.3 试验和报告负责人。
此外，鉴定报告还必须包括所有必要的信息，对试验过程和结果评价提供全面而准确的描述。必须包括摘要、资料分析和结论等，摘要必须对试验资料以及任何与对照组比较有异常的数据进行概括。
8 试验结果的解释
慢性经口性试验能够提供受试样品在长期接触该受试样品时的毒性作用资料，为拟定人类接触该化学物的职业接触限值（OEL）和每日容许摄入量（ADI）提供依据。但由于本试验并不主要研究受试样品致癌性，确定受试样品致癌性仍有限。
中国科学院广州化学研究所分析测试中心手机 / Tel: +86-13113316131电话 /Tel：020-18933946343传真 / Fax: +86-20- 8523 1035email: 13242059406@163.com
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