单次眼刺激试验、多次皮肤刺激试验、完整皮肤单次刺激试验、破损皮肤单次刺激试验
中国科学院广州化学研究所分析测试中心
卿工----13113316131
中国科学院分析测试中心由国务院吸收国外先进技术于2005年组建。下设危险废物鉴定实验室、二恶英实验室，化学与药学分析室，材料与形貌分析室，环境与能源分析室，生物与药学分析室。
皮肤刺激性是日常使用化妆品最常见的不良反应之一，皮肤刺激性试验是化妆品原料及产品安全性评价的主要项目，传统皮肤刺激试验采用实验动物进行。近年来，多种替代动物试验的体外模型被开发和应用。
日用化工产品通常引起刺激性皮炎、色素沉着和变态反应性皮炎等皮肤疾病，在化妆品所引起的病例中占到了95%以上。因此，皮肤刺激/腐蚀试验是化妆品总体安全评
价程序的一部分，特别是对于可能引起皮肤刺激或腐蚀作用的化妆品特殊组份，进行皮肤刺激/腐蚀试验十分必要。世界各国都把化妆品及其原料的皮肤刺激/腐蚀试验列为化妆品安全评价的检测内容。
一、化妆品的局部皮肤毒性反应
皮肤暴露于外源物质（包括化学品、药物或化妆品）可引起多种皮肤反应，反应早期通常是因皮肤屏障功能破坏而出现的皮肤干燥（水分失丢），然后形成红斑和水肿为特征的皮肤刺激反应；还有一部分是由于过敏导致的接触过敏和色素沉着。据报道，职业因素和化妆品引起的皮肤病中接触性皮炎约占90%以上，其中全部接触性皮炎病例中约70%为皮肤刺激性反应。临床上引起两种不同类型的炎症反应过程：刺激性和变态反应性皮炎。通常皮肤接触化学物质后，可观察和辨别到几种非免疫性的反应形式：
皮肤刺激性是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤，皮肤刺激反应一般无免疫系统的参与，其典型表现是红斑或水肿。皮肤腐蚀性指的是不可逆损伤，典型表现是溃疡、出血和血痂，以及由于皮肤漂白出现的脱色、脱发和疤痕。国际法规强制要求化学品上市前必须进行皮肤腐蚀性评价。但是腐蚀性并不是化妆品使用中希望发生的现象，只是由于制造商失误或消费者误用的情况下偶然发生的情况。另一方面，化妆品原料也可能本身具有腐蚀性，但在化妆品中并不排斥使用，因此终产品腐蚀性的大小与下列因素密切相关：化妆品中腐蚀物质的终浓度、中和物质的有无、赋形剂的使用、暴露途径以及使用条件等。
累积性刺激是重复暴露于外源物质发生的可逆刺激反应，接触此类物质引起的皮肤变化较缓慢，如皮肤增厚、皱纹产生和色素沉着等，这些变化是皮肤炎症的间接效应。
二、体内动物实验
传统皮肤刺激和腐蚀试验多采用动物进行。单次体内皮肤刺激试验一般用兔进行，每次试验至少选择4只健康的成年动物。如预期有刺激反应，初试应考虑使用1只动物。如没有出现明显的阳性反应（红斑或水肿记分大于2）时，应至少再使用2只动物进行试验。如预期无反应，初试可使用3只动物。在使用了至少3只动物后，如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。
多次体内皮肤刺激试验是指在7-14天内对实验动物进行重复皮肤染毒，对检测化妆品刺激性的效果比单次染毒效果好，特别适用于与皮肤长期密切接触的或反复使用的个人护理产品。每次试验选择三组以上的动物，每组动物雌雄各5-10只，各组分别接受不同剂量的受试物进行测试。根据产品的性质和用途，多次皮肤刺激试验进行染毒程序、方式和次数的调整。
体内皮肤腐蚀试验与刺激试验采用同一试验程序，不同之处在于动物反应程度的差异。对于预期具有腐蚀性的受试物，强烈建议只用一只动物进行初次试验。先后施用共3次斑贴，第一次斑贴在贴敷3min后去除。如果未观察到严重皮肤反应，则在不同的位点施用第二次斑贴，1h后去除。如果此时观察的结果表明动物能够忍受第三次暴露造成的痛苦，则第三次应在4 h后去除斑贴。记录每个时间点的反应程度。如果在连续的3次暴露后的任何一次观察到腐蚀效应（如溃疡、出血），则试验立即终止，如果最后一次斑贴去除后，仍未观察到腐蚀效应，动物应观察到14天。
为了提高皮肤评价试验的科学性，更好的体现3R原则，2002年版的OECD指南对皮肤刺激性的动物试验的有关条款进行了优化，采用新的试验策略，可以避免和减少不必要的动物皮肤刺激/腐蚀试验。这一策略基于如下阶梯式顺序：现有资料分析，pH值测定，使用经验证和接受的体外方法，最后进行对动物试验优化。在下列4种情况下，可不考虑进行皮肤腐蚀试验：①根据结构与活性关系或理化特性推断可能具有皮肤腐蚀性的物质，如强碱或强酸类，pH≤2.0或pH≥11.5；②经急性经皮毒性试验显示具有很强系统毒性的物质；③经腐蚀性试验的替代试验（如TER法、皮肤模型试验）的其中一种方法证明具有腐蚀性的物质；④急性经皮毒性试验中，染毒剂量达2000mg/kg时仍未产生皮肤刺激体征的物质。对于非腐蚀性物质也只有必要时才进行体内皮肤刺激试验。
三、体内人体皮肤刺激试验
人体皮肤贴斑试验包括单次、多次和加强暴露刺激试验等多种，其目的是检测受试物引起人体不良反应的可能性。人体试验一般是用来决定产品或配方的“皮肤相对兼容性”和进行局部“暴露”的风险评价，以证明这种物质应用于化妆品中第一次接触人皮肤或粘膜时对人体无损害。然而，如果只是为了危害评估，化妆品人体志愿者测试获得的数据存在一些特定的偶然性。
单次刺激贴斑试验是评价化妆品对皮肤刺激性的经典方法之一，通常采用芬兰斑试器（Finn chamber）或不同直径的Hilltop斑试器。实验方法有局部全封闭斑贴法和局部半封闭斑贴法，区别在于前者完全不透气，后者使用半封闭敷料固定，接触时间通常为24-48h。可根据实际情况进行调整。
对于使用频繁的化妆品多次刺激贴斑试验更有价值，因为某些化学物接触皮肤一次不产生刺激反应，但接触皮肤多次却可能引发强烈的刺激反应。多次斑贴试验可评估化妆品是否会引起累积性刺激反应或变应性接触性皮炎。可根据产品用途在指南原则下调整产品的皮肤接触时间、涂抹剂量、间隔时间和重复接触次数。
除了上述常规的皮肤斑贴试验外，还有几种改进的试验方法用于特殊用途化妆品的检测。皮肤划痕试验是一种用受损皮肤评估化妆品刺激反应的方法，肥皂小室试验专门用来研究肥皂是否导致皮肤干裂和剥落的一种试验，弯曲洗涤试验或肘关节弯曲洗涤试验主要应用于评估肥皂和去污剂接触人体皮肤产生刺激反应的情况。这些试验方法在产品研发、质控和检验评估过程中都有被应用。
人体志愿者的斑贴试验与体内动物实验的观察和分级是类似的，也包括红斑、水肿、水疱和焦痂等反应，具体分级及评估法可参考有关标准。除了主观性较强的肉眼评判外，还可借助检测仪器提高结果评价的客观性，如经皮肤水分流失（TEWL）和皮肤水份含量等。志愿者的测试实际上是一种小样本的人群流行病学调查，因而其结果用于预测化妆品应用到普通人群的情况存在不足，除了样本量的限制，对实验条件的控制也存在一定的难度，包括不同受试个体的皮肤可能存在差异、试验时使用的封闭涂抹条件与产品实际使用存在差异、不同试验环境条件存在差异等。
四、已认可的皮肤刺激试验体外方法
经过近20年的皮肤刺激试验体外替代方法的研究，目前，经过验证和认可的体外方法主要是人工皮肤模型法，该方法于2010年经OECD认可为指南439。
1、EpiSkin模型试验
EpiSkin是一种三维人体皮肤模型，由法国里昂的EPISKIN-SNC公司开发。用于替代皮肤刺激试验时，直接将测试物质局部应用于皮肤表面，然后用MTT法评价测试物对细胞活性的作用，以百分比细胞活性为检测终点用于区分皮肤刺激物和非刺激物。商品化的皮肤刺激检测试剂盒含培养基、试剂和12个表皮单位，表皮单位由具有屏障功能的重建表皮组成。可以检测所有剂型的化学物质，包括粉剂、液体、分散剂等。将受试化妆品（10uL/mg）涂抹于人工皮肤表面，作用30min后，去除受试物，继续孵育42小时，用MTT法测试细胞存活率，必要时辅以IL-1α测定。判断标准：与对照组相比细胞活性>50%表明受试物无刺激性，细胞活性≤50%，表明受试物具有刺激性。
2、EpiDermTM 模型试验
EpiDerm重建皮肤模型，由位于美国马里兰州阿什兰德的MatTek公司研发并生产。EpiDerm皮肤模型由来源于人皮肤的角质细胞生长于特殊制备的Millicell细胞嵌入培养板中，形成多层分化的人类表皮模型，模型由基底层、棘层、颗粒层和角化层组成，与体内皮肤结构类似。以EPI-200为例，试剂盒含24块人工皮肤组织，培养10天的人工皮肤以特殊制备的嵌入板为支持物，嵌入板包埋于含营养液的琼脂糖凝胶中便于运输，试剂盒还包括维持培养基和MTT检测成分。早期的判定方案是通过测定ET50值（接触化合物后使组织活性下降50%所需的暴露时间），通过与阳性对照相比来评估评估化合物的刺激性和非刺激性。后来，采纳了与EpiSkin类似的方案，即与阴性对照组相比，细胞活性<50%表明受试物具有刺激性。
3、SkinEthicTM模型试验
Skinethic是由位于法国尼斯的SkinEthic公司开发的人工皮肤模型。采用无血清培养基制备，制备过程是由培养人正常角质细胞于聚碳酸酯嵌入培养板，经气-液界面培养17天完全分化形成表皮结构。产品的质量控制，包括组织学观察和组织活性测定（MTT试验），如果OD值大于0.8，且组织学观察切片显示至少4层活性细胞层。已提出基于该方法的二步法急性和累积性刺激筛选系统，受试物作用30min后，去除受试物，再孵育42h检测组织活性，如果细胞活性<50%表明受试物具有刺激性。如果增加IL-1释放和形态学改变作为检测终点可提高检测的敏感性。
五、已认可的皮肤腐蚀试验的替代方法
皮肤腐蚀试验体外方法的前验证研究始于1994，经过10多年的努力，到2004年，国际社会基本接受的皮肤腐蚀试验的体外方法，主要有3项，分别是大鼠经皮电阻试验（TER）、CORROSITEX测试和人工皮肤模型试验（Episkin试验和EpiDerm试验）。
1、人工皮肤模型试验
体外重建皮肤模型EpiSkin是在胶原蛋白支持物上用人角质形成细胞培养的一种多层人体皮肤模。将受试物直接与EpiSkinTM模型作用3、60和240 min 3个时间，用MTT法检测受试物对细胞存活率的影响，阳性对照为冰醋酸或KOH，阴性对照为生理盐水。阴性对照的细胞相对活性设定为100%，每一样品测得的OD值与阴性对照相比，求出样品的细胞相对活性百分比，根据以下标准进行判定：受试物作用3min后，皮肤细胞活性≤35％，判定为EU R35类；受试物作用3min后，皮肤细胞活性≥35％，作用1h后细胞活性<35%，判定为 R34类；受试物作用4h后，皮肤细胞活性≥35％，结论为没有腐蚀性。
皮肤模型EpiDerm是用正常人表皮角质形成细胞（NHK）培养而成的一种多层皮肤模型，它包含基底层、棘层、微粒层和一层内含细胞间脂质的角质层。将受试物加在皮肤模型上3min～1h，然后用MTT法测定受试物的细胞毒性。暴露时间为3min和1h。阳性对照为冰醋酸或KOH，阴性对照为生理盐水。阴性对照的细胞相对活性设定为100%，每一样品测得的OD值与阴性对照相比，求出样品的细胞相对活性百分比，根据腐蚀性判定标准判断受试物是否具有腐蚀性。EpiDermTM模型的腐蚀性判定标准为：① 受试物具有腐蚀性：受试物作用3min后，皮肤细胞活性<50%；或受试物作用3min后，皮肤细胞活性≥50％，而且作用1h后细胞活性<15%。② 受试物没有腐蚀性：受试物作用3min后，皮肤细胞活性≥50％，而且作用1h后细胞活性≥15%。
2、大鼠皮肤经皮电阻试验
以经皮电阻值为检测终点，通过检测受试物对大鼠离体皮肤角质层完整性和屏障功能的损害能力，评定受试物的腐蚀性。选用28-30天龄的Wister大鼠的背部皮肤制作皮肤薄片。将其固定于PTFE管的末端，另一端连接电极。直接涂抹受试物与皮肤薄片作用24h后，去除受试物，用电极测量经皮电阻。阳性对照用HCL溶液，阴性对照选用蒸馏水。经皮电阻值＞5kΩ，评定该受试物无腐蚀性；如经皮电阻≤5kΩ，而且该受试物不是表面活性物质或中性有机溶剂，评定受试物具有腐蚀性；如果受试物为表面活性物质或中性有机溶剂，经皮电阻≤5kΩ，可增加硫丹明B染色剂穿透试验，以确定是否出现假阳性。
3、CORROSITEXTM皮肤腐蚀试验
CORROSITEX试验体系由人造的大分子生物膜和检测系统（CDS）两部分组成。蛋白大分子水凝胶生物膜模拟皮肤的正常功能，假定腐蚀性物质作用于生物膜与作用于活体皮肤的机制相似仿，将受试物作用于人工膜屏障的表面，检测由腐蚀性受试物引起的膜屏障损伤。通过多种方法检测膜屏障的渗透性，包括pH指示剂颜色的改变和指示剂溶液其他特性的改变。受试物开始作用于膜屏障到膜屏障渗透改变之间经过的时间（以min计）作为受试物腐蚀性分类和UN化学品包装分类（如果适用）的依据。对每一个试验方法，都有三种腐蚀性分类的截止时间值。根据截止时间对受试物腐蚀性的判定应当使腐蚀性危害最小化，即减少假阴性结果的出现。Corrositex最早由美国运输部认可用于危害化学物分类，ICCVAM认可其对酸、碱衍生物，以及以其为主要成份的配方的检测。该方法已经过验证，并被推荐为评估化学品皮肤腐蚀性危害分级测试策略的一部分。
六、未认可的体外皮肤刺激/腐蚀试验方法
1、离体皮肤模型试验
利用离体兔、人类或猪皮皮肤进行化学物质的局部皮肤毒性试验，试验采用嵌入式培养模型，检测终点采用MTT法，通过定量测定受试物作用皮肤不同时间后的效应，可用于区分急性和迟发性毒性作用，延长培养时间至7天，还可以区分化学品的不可逆的有害作用。离体皮肤可来自兔、猪或人，制备方法见第三节，将制备好的离体皮肤模型，经过夜培养后，更换新的培养液。测试化合物局部涂抹于皮片表面，作用4小时。除去测试化合物后，分别于0、24和48小时检测MTT。此外，根据实验目的，还可检测表皮细胞的增殖、中性红摄取和羟基脂肪酸释放。
2、非灌注猪耳试验
将猪耳暴露于试验物质，通过检测皮肤表面跨表皮水份丢失（TEWL）的绝对增加值，可用于区分受试物的刺激性和非刺激性。如果TEWL值大于6g/m2/h，则评定受试物具有刺激性。该方法在进行I期和II期验证的时候效果并不是特别的好，经改进后进入III期，所得结果的变异太大，目前试验方案仍在改进中。
3、小鼠皮肤完整性功能试验
将小鼠皮肤暴露于受试物一段时间后，用2种方法用于评估角质层的完整性，即跨表皮水份丢失（TEWL）和经皮电阻（ER）。SIFT预测模型的基础是比较应用测试物前后TEWL或ER的值，以大于或小于5倍说明测试物有或无刺激性。使用时，将受试物涂抹于小鼠完整皮肤上，作用一段时间后，测定接触受试物TEWL和电阻（ER）的大小，按下列公式计算TEWL比值和ER比值，评定受试物是否具有刺激性。正常小鼠完整皮肤模型的TEWL值为3-10(g/m2)，ER值为5-20kΩ。
4、结构-活性关系
化合物的皮肤刺激或腐蚀性反应的发生与其特定的化学功能基团或其分子结构直接相关，通过建立已知的皮肤刺激性/腐蚀性物质与其分子结构的可测量的参数之间的相互联系的模型，可将某一未知毒性反应终点的化学物的分子结构与之进行比较来预测未知化学物的反应终点。例如，通过对已知腐蚀性和非腐蚀性的酸、碱、亲电子试剂和某些中性有机物进行分析，提出了皮肤腐蚀性的QSAR模型。有的模型分析了不同种类的一组有机化合物，根据其熔点（Mpt）和分子重量（MW），按照以下的预测模型（PM）可以预测为腐蚀物或非腐蚀物，如果Mpt≥37℃且MW≤123 g/mol，预测为皮肤腐蚀物，否则预测为非腐蚀物。
小结
化妆品皮肤腐蚀的替代方法已被验证和被EU和OECD法规接受，所以从这一点上，动物试验是不能再进行了。皮肤刺激性的体外方法已通过验证，并正式列入OECD指南草案，有望在2年内正式发布成为新的试验指南。化妆品皮肤刺激性/腐蚀性的危害识别（或分类和标识）应采用逐层的策略，第一层是通过QSAR模型或专家系统预测皮肤的刺激性/腐蚀性，然后基于pH 测试和现有的皮肤吸收或急性毒性的数据，第二层是采用已验证的替代试验（大鼠皮肤TER检测、人体皮肤模型试验、CORROSITEX）或其它允许使用的体外方法，其结果可作为皮肤刺激性或腐蚀性的判定依据。上述试验为阴性的物质，必要时可进入第三层，进行4小时人体皮肤斑贴试验。因此，现有的体外方法可以完全替代动物测试，不仅可用于化妆品研发过程中原料和成品配方的日常评估，还可应用于法规监管目的。
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