非洲猪瘟病毒荧光 PCR 核酸检测试剂盒（快提+预分装）

使用说明书 兽用 【操作步骤】

一、样品制备

1、血液样品：采集抗凝血（抗凝剂为 EDTA）或血清样品，编号备用。

2、组织样品：采集、肝、淋巴结、扁桃体等病变组织样品或软蜱 0.1g(黄豆粒大小)，眼科剪剪

碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加 1mL 生理盐水混匀，4℃条件下 8000 rpm/分钟离心 2 分

钟，取上清液于灭菌离心管中，编号备用。

二、DNA 提取

取反应液 A 20μL 分别加入到新的 1.5mL 离心管，加入抗凝血或血清或组织上清液 2 μL，混匀，室

温（20℃左右）静置 3 分钟，加入反应液 B 20 μL，吹打混匀即可，若为抗凝全血，则需 8000rpm/分钟再

离心 2 分钟后做为待检 DNA 溶液。

三、PCR 扩增

1、试剂准备：根据当次实验所需要的反应数（反应数=待检样本数+阴性对照+阳性对照），取等量的

八联 PCR 反应管，在室温融化后，瞬离，并做好相应标记（操作过程要避光），剩余试剂放回-20℃冷冻

保存；

2、加样扩增：分别向 PCR 管中加入 5 μL 待检样本 DNA 或阴性对照或阳性对照，混匀并瞬离，放入

荧光 PCR 仪上运行以下程序：

荧光通道选择 FAM，在 40 循环阶段每个循环的 55℃时收集荧光信号。设置扩增体系为 25 μL，同时

要选择 passive reference 和 quencher 为 none 的模式。

（注：若荧光 PCR 仪(如 ABI7500)按说明书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行，可将预扩增和 PCR

扩增条件变更为 95℃：5 秒 55℃：30 秒。）

【结果判定】

1、基线和阈值设定：参照仪器自动产生或设定的阈值，手动阈值参照阴性对照上线设定。

2、质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，Ct 值为＞38 或无；阳性对照

的 Ct 值应≤30.0，且明显的扩增曲线；否则实验视为无效。

3、样品判定：待检样品荧光信号有指数型增加，且结果显示 Ct 值＜35.0，报告为阳性；未检测到 Ct

值或 Ct 值＞38 或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。35≤Ct 值≤38 时，复检一次，重复结果为阳性者判

定为阳性，否则判定为阴性。

【注意事项】

1、实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等控制可以获得好的结果。

2、实验室应严格按照有关规定分区管理。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。

3、有关耗材确保洁净、无菌，酸提取完成后尽快进入下一步试验或冷冻保存。

4、对于荧光 PCR 管要避免徒手或使用过的手套接触，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。

5、冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底，操作时应注意避光，避免强

光暴露和长时间光照。

6、样品、阴性对照封盖后，在通风环境添加阳性对照并及时封盖，避免组分间及气溶胶等假阳性污染。

7、扩增反应完毕后的 PCR 管严禁开盖，应和产生的其它试验废弃物一起及时收集，远离 PCR 实验室

进行无害化处理。

【规格】48 头份/盒。

【贮藏与有效期】-20℃以下避光保存，有效期 12 个月。

仅供兽医诊断使用